Skip to content

Recesywna forma zespołu Ehlersa-Danlosa spowodowana niedoborem Tenascin-X cd

1 miesiąc ago

461 words

Dolna granica wykrywalności testu ELISA dla tenascyny-X wynosiła 100 pg na mililitr. Tabela 1. Tabela 1. Poziomy w surowicy Tenascyny-X i Tenascyny-C. Półilościowy test ELISA został po raz pierwszy zastosowany do badania pacjentów z zespołem Ehlersa-Danlosa, osób zdrowych oraz pacjentów z łuszczycą lub reumatoidalnym zapaleniem stawów w pojedynczym (1:50) rozcieńczeniu surowicy. W celu ilościowego oznaczenia tenascyny-X (Tabela 1), przetestowaliśmy seryjne rozcieńczenia surowicy. Pacjentów z zespołem Ehlersa-Danlosa i populacją kontrolną porównano poprzez analizę wariancji z testami post hoc za pomocą testu wielokrotnego zakresu Duncana.
Wybarwiliśmy immunologicznie kriosekcję próbek pobranych z biopsji skóry dla tenascyny-X i tenascyny-C przy użyciu opisanych powyżej antyserum. Skrawki parafiny barwiono hematoksyliną i eozyną lub surowicą odpornościową na kolagen V (Dako, Carpinteria, CA). Drugorzędowe antyserum (biotynylowane anty-królicze lub immunoglobuliny świnki morskiej), a następnie kompleks peroksydazy skoniugowany z awidyna-biotyna i aminoetylokarbazol jako substrat chromogenny (Vector Laboratories). Przeprowadzono blotting Western supernatantu surowicy i hodowli fibroblastów, jak opisano wcześniej
Hodowlę komórkową
Stosowano pierwszy lub trzeci pasaż ludzkiej skóry z fibroblastami. Komórki hodowano w pożywce Eagle H21 zmodyfikowanej przez Dulbecco (GIBCO BRL, Rockville, Md.), Uzupełnionej 10% surowicą płodową, kwasem L-askorbinowym (20 .g na mililitr), penicyliną i streptomycyną. Kondycjonowaną pożywkę zebrano z konfluentnych hodowli w celu oznaczenia tenascyny-X metodą ELISA i Western blotting.
Wykrywanie mutacji
Dodatek Dodatek 1. Sekwencje primerów do amplifikacji i kompletne sekwencjonowanie sekwencji kodującej Tenascin-X. Genomowy DNA przygotowano z krwi obwodowej lub fibroblastów, a detekcję łańcuchowej reakcji reakcji PCR (PCR) delecji tenascyny-X 30 kb przeprowadzono jak opisano wcześniej.23 Sekwencję kodującą tenascynę-X amplifikowano PCR z 23 pary primerów, z wyżarzaniem w temperaturze 62 ° C i wydłużaniem przez 2,5 minuty w temperaturze 72 ° C przez 35 cykli. Region 12,5 kb kodujący tenascynę-X zsekwencjonowano bezpośrednio z produktów PCR z użyciem 42 starterów. Sekwencje starterów stosowanych do PCR i sekwencjonowania DNA oraz rozmiary wzmocnionych produktów są dostępne jako Dodatek Dodatek wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie http://www.nejm.org.
Wyniki
Nieobecność Tenascyny-X w surowicy pacjentów z zespołem Ehlersa-Danlosa
Rysunek 1. Rysunek 1. Wykrywanie tenascyny-X w pożywce i surowicy hodowlanej. Figura pokazuje Western blot pożywki kondycjonowanej fibroblastami i surowicy od zdrowego osobnika i od pacjenta z niedoborem tenascyny-X. W pożywce kondycjonowanej przez normalne fibroblasty wykryto monomer tenascyny-450 kD, podczas gdy w surowicy występował jedynie gatunek o masie cząsteczkowej 140 kD. Nie wykryto żadnego immunoreaktywnego materiału w pożywce fibroblastowej lub surowicy od pacjenta z niedoborem tenascyny-X.
Tenascyna-X jest zwykle wydzielana przez fibroblasty skóry jako białko o masie 450 kD, które można wykryć za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko jego terminalowi karboksylowemu (Figura 1). Ponieważ tenascynę-C znaleziono w surowicy, przetestowaliśmy normalną ludzką surowicę na obecność tenascyny-X
[więcej w: odma podskórna, homilopatia, psychozy endogenne ]
[patrz też: rozedma podskórna, zgrubienie opłucnej, padaczka pourazowa objawy ]